本期内容将从如下5个维度分析从TCR测序到TCR-T构建的方法：
- 第一、测序方法
- 第二、测序前细胞分选方法
- 第三、TCR测序对应的抗原数量
- 第四：TCR-T细胞的构建数量
- 第五：TCR-T细胞的基因修饰方法
主要涉及文章如下：
Neoantigen-targeted CD8+ T cell responses with PD-1 blockade therapy
发表于Nature 杂志(2021年影响因子 69分 )
1、测序方法：使用DNA编码标记的pMHC多聚体标记不同T细胞克隆，进行TCR测序(NGS)
2、测序前细胞分选方法, 使用pMHC多聚体荧光+、抗CD8+、抗CD95阳性细胞分选
3、TCR测序对应的抗原数量为242种抗原
4、TCR-T细胞的构建种类：构建了62种不同的TCR受体对应的T细胞
5、TCR-T细胞的基因修饰方法：使用同源重组载体向患者T细胞转入抗原特异性TCR基因，并使用CRISPR–Cas9方法敲除患者内源性TCR基因
Broadly applicable TCR-based therapy for multiple myeloma targeting the immunoglobulin J chain
发表于Journal of Hematology & Oncology杂志(2021年影响因子 23分 )
1、测序方法：常规NGS TCR测序
2、测序前细胞分选方法：pMHC四聚体磁珠分选抗原特异性T细胞
3、TCR测序对应的抗原数量：4种
4、TCR-T细胞的构建种类：共构建4种TCR-T细胞
5、TCR-T细胞的基因修饰方法：逆转录病毒载体向小鼠T细胞转入目标TCR序列
Identification of HPV16 E1 and E2-specific T cells in the oropharyngeal cancer tumor microenvironment.
发表于Journal for Immunotherapy of Cancer杂志(2021年影响因子12分 )
1、测序方法：使用DNA编码标记的pMHC多聚体、细胞表面标志物抗体标记不同T细胞，进行单细胞TCR测序(含单细胞mRNA测序)
2、测序前细胞分选方法：CD3、CD8、CD4磁珠分选T细胞
3、TCR测序对应的抗原数量：13种
4、TCR-T细胞的构建种类：构建了20种不同的TCR受体对应的T细胞
5、TCR-T细胞的基因修饰方法：慢病毒转染TCR至J76-CD8-NFAT-GFP 细胞
Generation of TGFβR2(-1) neoantigen-specific HLA-DR4-restricted T cell receptors for cancer therapy
发表于Journal for Immunotherapy of Cancer杂志(2021年影响因子12分 )
1、测序方法：使用5’RACE PCR扩增TCR cDNA全长后克隆至TOP10感受态细菌，Sanger测序，每种TCR转染序列测序50个细菌单克隆。
2、测序前细胞分选方法：流式分选INF-gamma和CD4+ T细胞
3、TCR测序对应的抗原数量：1种
4、TCR-T细胞的构建种类：针对一种抗原靶标构建15种TCR-T细胞
5、TCR-T细胞的基因修饰方法：逆转录病毒载体向人原代T细胞转入目标TCR序列，转染前剔除CD8+ T细胞
PRAME and CTCFL-reactive TCRs for the treatment of ovarian cancer.
发表于Frontiers in Immunology杂志(2021年影响因子8分 ) ：
1、测序方法：常规NGS TCR测序
2、测序前细胞分选方法：pMHC四聚体流式分选抗原特异性T细胞
3、TCR测序对应的抗原数量：17种
4、TCR-T细胞的构建种类：构建4种TCR-T细胞
5、TCR-T细胞的基因修饰方法：逆转录病毒载体向人原代T细胞转入目标TCR序列
Targeting the recurrent Rac1P29S neoepitope in melanoma with heterologous high-affinity T cell receptors.
发表于Frontiers in Immunology杂志(2021年影响因子8分 ) ：
1、测序方法：使用5’RACE PCR扩增TCR cDNA全长后克隆至TOP10感受态细菌，Sanger测序，每种TCR转染序列测序1个细菌单克隆。
2、测序前细胞分选方法：流式分选pMHC四聚体和CD8+ T双阳性细胞
3、TCR测序对应的抗原数量：6种
4、TCR-T细胞的构建种类：构建3种TCR-T细胞
5、TCR-T细胞的基因修饰方法：逆转录病毒载体向人原代T细胞转入目标TCR序列
Identification of T Cell Receptors Targeting a Neoantigen Derived from Recurrently Mutated FGFR3
发表于Cancers杂志(2021年影响因子6分 ) ：
1、测序方法：TCR测序(NGS)
2、测序前细胞分选方法：pMHC四聚体流式分选抗原特异性T细胞
3、TCR测序对应的抗原数量：1种
4、TCR-T细胞的构建种类：构建3种TCR-T细胞
5、TCR-T细胞的基因修饰方法：逆转录病毒载体向人原代T细胞转入目标TCR序列，为了减少患者内源性TCR感染，使用鼠源TCR恒定区改造目标TCR
总结
本文总结7篇文章的第三阶段策略，其共同目标是构建抗原杀伤T细胞，主要过程是对抗原特异性T细胞捕获测序后，构建TCR-T细胞。
在测序环节，主要是2种测序方法：
1、一代测序法：体外构建TCR克隆菌株后测序；
2、二代测序法：对捕获后T细胞的所有TCR克隆进行测序，由于事前均使用了Pmhc四聚体分选了T细胞，因此TCR测序结果的克隆类型单一，主要以抗原特异性TCR为核心克隆。特别说明的是，有两篇文章使用了DNA编码标记的pMHC四聚体进行TCR测序，从而同一批样本可并行完成多种抗原的TCR测序。
在TCR-T构建环节，由于同一种pMHC结合的TCR可能由于亲和力差异出现细胞杀伤效果的显著不同，因此，所有文章均同时制备了多种TCR-T进行比较。构建主要方式有两种：
1、患者原代T细胞改造：多使用逆转录病毒作为TCR改造载体。为了追求更具靶向性的杀伤效果，患者内源性TCR的干扰需要避开。有两种方法用于减少患者内源性TCR的干扰，一种方法是CRISPR–Cas9方法敲除患者内源性TCR，另一种方法是利用鼠源TCR的恒定区改造TCR。
2、使用慢病毒转染TCR至J76-CD8-NFAT-GFP/Luc 细胞，通过报告基因的方法评估TCR激活的效应。
